Nature：昼夜节律自噬驱动 iTRF 介导的长寿

 限时喂养 (TRF) 最近作为从果蝇 到人类的生物体的潜在抗衰老治疗方法而受到关注 。TRF 将食物摄入量限制在一天中的特定时间。由于 TRF 控制进食时间，而不是营养或热量含量，因此假设 TRF 取决于昼夜节律调节功能；其作用的潜在分子机制尚不清楚。

2021年9月哥伦比亚大学学者 Mimi Shirasu-Hiza于Nature发表文章Circadian autophagy drives iTRF-mediated longevity其研究表明昼夜节律调节的自噬是 iTRF 介导的果蝇健康益处的关键因素. 由于昼夜节律调节和自噬都是人类衰老过程中高度保守的过程，这项工作强调了刺激昼夜节律调节自噬的行为或药物干预可能为人们提供类似的健康益处

图 1：iTRF 可在不限制饮食的情况下延长寿命和健康寿命。

iTRF 延长果蝇寿命

研究人员测试了四种 TRF 时间表，偏向于夜间禁食，以延长寿命（图1a）。对照饮食提供 24 小时的食物获取。标准 TRF 计划（开灯 12 小时进食，关灯 12 小时禁食）相对于对照饮食不会延长寿命，除非仅限于成年 10-40 天（羽化后天数）；TRF-介导的寿命延长为从试验温和的和不一致的审判。相比之下，禁食 24 小时（随后是 1-2 天的随意喂养）缩短了寿命，如之前所示。通过反复试验，研究人员确定了一个可以大大延长寿命的中间喂养计划（图1a）。苍蝇每隔一天禁食 20 小时，从中午开始（灯亮后 6 小时或 Zeitgeber 时间 6 (ZT6)），在禁食日之间有一个随意饮食的恢复日。尽管在老年期间保持这种饮食不会延长寿命，但在 10 至 40 天的 30 天窗口内保持这种饮食会导致一致的、显着的寿命延长（图1b）。这种饮食在不同年龄（第 10-20、20-30 或 30-40 天）的较短 10 天窗口逐渐延长寿命; 相比之下，这种饮食的 10 天窗口期与较老的果蝇（40-50 天）并没有延长寿命。相对于随意饮食的动物，从第 10 天到 40 天，采用这种饮食的动物的平均寿命增加了 18%（雌性果蝇）和 13%（雄性果蝇）；此后，研究人员的实验集中在雌性果蝇上。研究人员将这种延长寿命的饮食方案称为 iTRF。

iTRF 不同于饮食限制

首先测试了 iTRF 是否会导致热量限制或减少食物摄入，众所周知，这可以延长寿命1 , 7。为了测试食物摄入量，研究人员通过毛细管喂食器 (CaFe) 测定8、9测量了在禁食和再喂食的三个周期内随意和 iTRF 饮食中苍蝇的摄食率。相对于随意饮食的对照动物，iTRF 饮食的果蝇在恢复期间表现出补偿性喂养，导致超过 48 小时（禁食日加喂食日）的平均食物消耗略有增加（图 2)。因此，iTRF 不会通过限制营养摄入来延长寿命。

在苍蝇中，两个既定的延长寿命的操作是饮食蛋白质限制 (DR) 和胰岛素样信号 的抑制。为了测试 iTRF 是否通过 DR 起作用以延长寿命，研究人员使用随意或 iTRF 方案滴定蛋白质浓度（图1d）。如果 iTRF 仅通过 DR 起作用，研究人员不会期望 iTRF 和 DR 具有累加效应。研究人员发现 iTRF 和 DR 可以相加作用。因此，iTRF 介导的寿命延长可以独立于 DR 介导的寿命发挥作用。类似地，通过消融大多数产生胰岛素的细胞来抑制胰岛素样信号传导，使得典型的 iTRF 介导的寿命延长与对照组相似。总之，这些结果表明 iTRF 介导的寿命延长与由于 DR 或胰岛素样信号传导的抑制而导致的寿命延长不同。

iTRF 延长了健康跨度

首先，为了评估整体肌肉/神经元功能，研究人员测定了攀爬能力。相对于随意饮食的苍蝇，iTRF 上的苍蝇表现出与年龄相关的攀爬能力下降较少（图1e）。其次，为了测量与年龄相关的蛋白质聚集的保守标记，研究人员从 iTRF 前和 iTRF 干预后（7 天和 40 天大）的 iTRF 和随意饮食的苍蝇的全果蝇提取物中提取 Triton 不溶性部分，然后泛素（图1f）和果蝇直系同源物 p62/SQSTM1/ref(2)P（以下简称 p62）的蛋白质印迹分析。对于这两种标记，iTRF 上的果蝇相对于对照（随意）果蝇的不溶性部分的水平降低，表明与衰老相关的蛋白质聚集较少。第三，研究人员使用共聚焦免疫荧光显微镜使用抗多聚泛素和抗 p62 抗体直接测量肌肉中的蛋白质聚集。同样，相对于随意饮食的对照，iTRF 显着减少了老年苍蝇飞行肌肉中多聚泛素和 p62 聚集体的数量和面积。第四，由于肠道功能下降是另一个保守的衰老标志物，研究人员测量了与衰老相关的肠道干细胞过度增殖、肠道完整性和肠道微生物负荷。相对于随意饮食的对照，iTRF 降低了这些肠道老化标志物。最后，因为饮食会影响肠道微生物，从而影响衰老，研究人员测试了 iTRF 介导的寿命延长是否取决于与苍蝇相关的微生物。在禁食和喂养阶段使用抗生素治疗将相关微生物消耗到几乎检测不到的水平; iTRF 在抗生素处理的果蝇中引起与载体对照相同的寿命延长，表明 iTRF 介导的寿命延长不依赖于与果蝇相关的微生物。总之，这些结果表明，相对于随意饮食的对照，iTRF 降低了多个衰老参数，并表明 iTRF 通过增加健康寿命和延缓衰老来延长寿命。

图 2：iTRF 介导的寿命和健康寿命延长需要核心生物钟组件。

iTRF 需要完整的生物钟

由于 iTRF 不会改变饮食成分，但会控制进食时间，因此研究人员检查了调节生理功能时间的生物钟成分的作用。昼夜节律钟分量动物之间高度保守的和调节转录24小时的振荡，其中背后24小时的振荡生理和行为。核心生物钟组件形成转录负反馈回路：在果蝇中，时钟 (Clk) 和循环 (Cyc) 蛋白激活数百个基因的转录，包括许多代谢基因和昼夜节律调节剂period ( per ) 和timeless ( tim )，它们的基因产物抑制了 Clk 和 Cyc 的活性（图2a）。

其他研究表明，TRF 方案可增强昼夜节律基因表达。为了证实 iTRF 的这种效果，研究人员每 4 小时对随意和 iTRF 饮食的动物进行定量实时 PCR (qRT-PCR) 分析，持续 48 小时。iTRF 加宽了时钟(Clk) 表达的白天峰值（图2b）并增加了per和tim基因表达的幅度，特别是在夜间/禁食阶段（图2c）。因此，与其他 TRF 方案类似，iTRF 可增强昼夜节律基因表达。

为了测试 iTRF 介导的寿命延长是否需要生物钟组件，研究人员比较了几种心律失常的昼夜节律突变体及其对随意和 iTRF 饮食的遗传控制：Clk jrk、cyc 01、per 01和tim 01突变体和具有 CRISPR 介导的突变体中断每（每CRISPR）或添（添CRISPR）（图2D，E）。虽然遗传控制在 iTRF 上表现出显着的寿命延长，但昼夜节律突变体却没有。如前所述，per 01和cyc 01突变体对 DR反应正常。饥饿和喂养分析证实，像控制，每01突变体没有期间或之后20小时禁食时期模具和具有增加的供给补偿快速周期。总之，研究人员的结果表明 iTRF 介导的寿命延长需要功能性生物钟。

为了测试 iTRF 介导的寿命延长是否需要夜间禁食，研究人员测试了日偏 iTRF，偏移 12 小时（第二天 ZT18-ZT14），主要是白天禁食。虽然相对于随意饮食的对照组而言，夜间偏倚 iTRF 显着延长了寿命，但偏昼 iTRF 却没有。per 01突变体不受任一 iTRF 方案的影响。这一结果表明 iTRF 寿命延长需要夜间禁食。

为了测试 iTRF 介导的健康跨度扩展是否依赖于生物钟，研究人员测量了每个01突变体和 iTRF 或随意饮食的遗传控制的年轻人和老年人的攀爬能力和泛素化蛋白质积累。虽然ITRF保存爬坡能力和相对于那些随意的饮食控制降低了泛素化蛋白的水平，每01突变体并没有对国际地球响应，并表现出老化相关的爬坡能力相似的下降和增加蛋白质聚集每01突变体对自由采食饮食（图2g，h）。因此，iTRF 介导的寿命和健康寿命延长需要功能性生物钟和夜间禁食。

图 3：iTRF 介导的寿命延长需要自噬介质。

iTRF 需要自噬成分

因为TRF涉及禁食，研究人员检查了自噬作用，饥饿诱导的细胞过程中的再循环的大分子（图3A）。研究人员首先使用 qRT-PCR 来测试两种保守的自噬介质 Atg1 和 Atg8a（分别是 ULK1 和 LC3 的哺乳动物同源物）是否在果蝇中受昼夜节律调节。与其他模式生物和细胞培养物的结果相一致，二者ATG1和atg8a是在果蝇昼夜节律调节的，与夜间表达峰值（图3b，C）。类似昼夜基因，ITRF增强夜间表达ATG1和atg8a在对照中（图3b、c、虚线）但不是在per 01突变体中。因此，两个关键自噬基因的表达受昼夜节律调节并被 iTRF 增强。

为了测试 iTRF 是否诱导自噬，作者测量了自噬、自噬通量和自噬体/自噬溶酶体形成的信号标志物。研究人员比较了 iTRF 和随意饮食中的遗传对照和per 01突变体，预测如果自噬是 iTRF 中关键的昼夜节律调节功能，则per 01突变体不会响应。研究人员首先检查了与自噬诱导相关的两个信号标记：AMPK 磷酸化增加和 S6K 磷酸化减少。与 iTRF 增强的昼夜节律调节的自噬一致，相对于基因控制的随意饮食，iTRF 禁食期增加了磷酸化 AMPK 并降低了磷酸化 S6K 水平，但不是每01突变体。接下来，研究人员使用 mCherry 标记的 Atg8测量了随意和 iTRF 饮食中对照和每个突变体的自噬通量。游离 mCherry 与 mCherry-Atg8a 的比率反映了自噬活动，因为 Atg8a 在自噬过程中在溶酶体中迅速被破坏，而 mCherry 更稳定。相对于随意饮食，iTRF 在对照中诱导高水平的自噬，而在per 01突变体中显着减少（图3d）。最后，研究人员直接监测自噬体形成，溶酶体丰度和通过自噬体标记GFP-Atg8a相对于溶酶体标记溶酶体示踪剂的活荧光成像在肠自溶酶体形成。相对于随意饮食，iTRF 在对照中增加了活性自溶酶体，但在per 01突变体中没有增加（图3e）。因此，自噬的 iTRF 诱导与寿命延长相关，并取决于生物钟。

为了确定 iTRF 介导的寿命延长是否需要自噬成分，研究人员首先通过驱动显性阴性 (DN) 或组成型活性 (CA) AMPK 和 S6K 的表达来操纵自噬调节 AMPK 和 TOR 信号通路。在随意饮食中，这些已知的衰老调节剂具有预期效果，促自噬操作延长寿命，自噬抑制缩短寿命。在 iTRF 上，虽然 DN-S6K 不影响 iTRF 介导的寿命延长，但相对于对照（超过 18%），DN-AMPK、CA-AMPK 和 CA-S6K 部分抑制了 iTRF 介导的寿命延长（约 10%）。因此，与胰岛素信号传导相反，操纵这些自噬调节途径会影响 iTRF 介导的寿命。

为了直接测试 Atg1 和 Atg8a 的作用，研究人员使用 UAS-RNA 干扰 (RNAi) 介导的通过普遍存在的可诱导驱动程序（daughterless-GeneSwitch-GAL4（daGS-GAL4））介导的敲低来敲低atg1和atg8a 的表达。该实验还测试了发育效应，因为在成年第 5 天开始给果蝇喂食诱导药物 RU486 或载体对照。对照中atg1或atg8a 的RNAi 敲低阻止了 iTRF 介导的寿命延长（图3f，g）和atg1敲低per 01突变体没有影响（图3h）。单独喂食 RU486 不会影响缺乏 UAS-RNAi 转基因的果蝇的寿命延长。总之，这些数据表明自噬的激活对于 iTRF 介导的长寿是必要的。

图 4：增加自噬促进基因的昼夜节律调节表达足以实现 iTRF 的健康益处。

iTRF 需要昼夜节律自噬

为了测试自噬的昼夜节律操纵是否影响 iTRF 介导的健康益处，研究人员利用了昼夜节律启动子和 UAS-GAL4 系统（图4a）。研究人员使用per - GAL4和tim - GAL4分别驱动 RNAi 构建体针对atg1和atg8a 的高夜间和低日间表达，通过 qRT-PCR 和蛋白质印迹分析确认基因和蛋白质表达（图 2）。夜间 RNAi 敲低atg1或atg8a 的苍蝇对 iTRF 没有反应，表明iTRF 介导的寿命延长需要夜间atg1和atg8a表达。

因为已知增加的自噬可以延长寿命，研究人员测试了昼夜节律调节的自噬诱导与per - GAL4和tim - GAL4，分别驱动atg1和atg8a，是否足以延长 iTRF 寿命。更强的tim - GAL4驱动因子与atg1结合诱导早期致死。atg1或atg8a夜间特异性过度表达的苍蝇不仅在随意饮食中表现出类似 iTRF 的寿命延长，而且在 iTRF 上也没有表现出额外的寿命延长（图4c、d）。这表明，如果昼夜节律调节的自噬已经增强，iTRF 就没有作用。tim - GAL4驱动的 mCherry 标记的 Atg8a 表达具有相似的结果，并且蛋白质印迹分析证实了蛋白质水平的昼夜节律振荡以及自噬的诱导。这些结果表明，增强昼夜节律调节的自噬是推动 iTRF 介导的寿命延长的主要机制。

为了证实寿命延长反映了衰老延迟，研究人员测试了atg1 RNAi 和过表达突变体以及随意和 iTRF 饮食的对照，以观察与年龄相关的攀爬能力下降和蛋白质聚集增加。与昼夜一致ATG1为寿命延长的要求，昼夜击倒ATG1防止ITRF介导的长期保健延伸。类似地，atg1 的昼夜节律过表达导致随意饮食的果蝇的 iTRF 样健康寿命延长，而 iTRF 没有额外改善。这表明atg1 的昼夜节律表达 对 iTRF 介导的寿命和健康寿命延长而言是必要的和充分的。

为了在药理学上增强昼夜节律调节的表达，研究人员使用 RU486 诱导型daGS - GAL4在夜间/禁食阶段随意饮食的苍蝇中过度表达atg1（图4e）。类似于per - GAL4驱动atg1，夜间特异性 RU486 诱导的atg1过表达足以在随意饮食中延长 iTRF 样寿命，并抑制 iTRF 上的进一步寿命延长（图4f）。表明atg1 per 01突变体中的表达本身不足以完全响应 iTRF。

因为夜间特异性 RU486 诱导的自噬足以延长 iTRF 样寿命，研究人员测试了白天特异性 RU486 诱导的自噬。研究人员开发了一种夜间偏向的 12:12 TRF 方案，其中包括 12 小时禁食 (ZT9–ZT21) 和 12 小时喂养 (ZT21–ZT9)，没有恢复日；关灯后的 3 小时偏移消除了晚餐，并允许充分禁食以延长类似于 iTRF 的寿命（图4e）。与这种转变的 12:12 TRF 类似，atg1（ZT9-ZT21）的夜间特异性 12 小时 RU486 诱导产生了类似 iTRF 的寿命延长，从而阻止了进一步的 TRF 寿命延长（图4h）。相比之下，特定日禁食和/或 RU486 治疗（ZT21-ZT9）并没有延长寿命（图4i）。每01突变体对移位的 TRF 没有反应。这些数据表明夜间特异性增强的atg1表达对于 iTRF 介导的寿命延长既必要又充分。总之，研究人员的结果支持巨自噬的时钟依赖性增强介导 iTRF 介导的寿命延长的影响的假设。

昼夜节律调节和自噬控制衰老和寿命。在这里，研究人员确定了生物钟组件（Tim、Per、Cyc 和 Clk）和基本的自噬组件 Atg1 和 Atg8a，它们对于 iTRF 的抗衰老、延长寿命的益处都是必要和充分的。虽然之前的一项小鼠研究发现 TRF 介导的针对高脂肪饮食的保护不需要生物钟，但最近的一项苍蝇研究证实了研究人员的发现，即 iTRF 介导的寿命延长需要功能性生物钟。 由于细胞自噬靶标（蛋白质、脂质、核苷酸和细胞器）的多样性，确定 iTRF 介导的自噬相关健康益处所涉及的主要组织和特定靶标是未来工作的挑战。衰老是导致死亡的主要危险因素，会引发导致代谢、心血管和神经退行性疾病的病理过程。作为一种简单的饮食干预策略，iTRF 似乎既高效又具有多效性，对多种组织具有健康益处，并提供了一种潜在的抗衰老方法。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-03934-0

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